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class 2 crispr:从基因编辑到靶点发现时间:2017-06-28

前言

近些年,crispr-cas系统频频登上“cns”,其强大的基因编辑能力迅速让其从基础研究转化到临床试验。随着越来越多crispr-cas家族成员的发现以及基础研究的进展,crispr的应用范围也越来越广。今天,小编就详细介绍下class 2家族crispr的作用机制,以及它们在基因编辑,靶点发现,核酸   检测等多方面的进展。


crispr系统简介与分类

为了应对外来病毒和质粒的入侵,细菌和古生菌进化出了一套获得性免疫系统crispr-cas。crispr-cas系统主要包括由cas基因组成的操纵子和crispr阵列,其中crispr由外来基因组靶标序列(spacers)和相同的重复序列(direct repeat)所构成。crispr-cas系统发挥作用主要包括adaptation,crrna maturation以及interference三个过程:首先在cas1,cas2等蛋白的作用下,将外来dna序列组装到crispr阵列中,接着在系统外的rnase iii或者系统自身效应蛋白的作用下,完成pre-crrna的切割,最后效应蛋白在crrna的引导下靶向目的dna/rna,从而发挥干扰作用。与class 1 cripsr需要多个蛋白构成效应复合物不同,class 2 crispr只需要单个效应蛋白。根据效应蛋白的不同,class 2又可以进一步分为三个不同类型,分别是以cas9为代表的type ii,以cpf1为代表的的type v和以c2c2为代表的的type vi。



class2 cripsr简介:cas9,cpf1与c2c2

crispr-cas9是目前为止研究最深,应用最广的cripsr系统,它与后发现的type v家族cpf1都能够靶向目的dsdna,但是两者相比有以下明显不同:1. cpf1只需要一个crrna完成目的序列的靶向,而cas9中需要crrna和tracrrna两个分子来完成;2. cpf1识别3’富含t的pam序列,而cas9识别5’富含g的pam序列;3. 在cas9中有hnh和ruvc两个活性结构域分别切割目标dna的互补链和非互补链,而在cpf1中一个全新的活性结构域nuc,和ruvc分别切割目标dna的互补链和非互补链;4. cas9在pam临近的位置切割dna产生平末端,而cpf1在pam远端切割dna产生突出的末端。而type vi家族c2c2是一个rna-guided的rnase,它含有两个hepn结构域。在识别了目的rna后,c2c2就变成了一个非特异的rnase,因此导致细胞毒性与程序性死亡。


随着cas9, cpf1, c2c2的结构被解析,人们对于这些蛋白的机制和应用理解更深入。crispr技术引领了一波生物技术革新,由于其精确靶向性和易操作性,cas9和cpf1被广泛应用于基因编辑于基因治疗,而c2c2也能够用于基因沉默与核酸检测。这些技术将在下文向大家介绍。



crispr与基因编辑

虽然大部分class 2 crispr蛋白在体外都具有切割活性,然而只有少数被证明能够用于哺乳动物细胞的编辑。此外,由pam带来的序列限制性,dna特异性带来的脱靶现象等,也是基因编辑中亟待解决的问题。

       

pam序列特异性的改造以最常用的spcas9为例,其pam序列ngg在人类基因组上平均每8-12bp就会出现一次,这个频率基本能满足经典的hdr或者nhej为基础的基因编辑。然而对于一些需要单个核苷酸分辨率的情况,或者如sacas9中,pam序列为nngrrt,此时的pam特异性就会成为一个重要的限制。为此,如何减少pam的限制,扩展cas9的靶向范围是非常具有意义的。


现在已有一些工作,通过突变cas9蛋白的一两个氨基酸,从而改变其pam的特异性。野生的fncas9的pam序列为ngg,而e1369r/e1449h/r1556a三突变rhafncas9则可将pam序列放宽至yg。通过细菌选择系统筛选得到的突变体vqrspcsa9 (d1135v/r1335q/t1337r) 可识别pam为nga和ngcg,eqr spcas9(d1135e/r1335q/t1337r)可以识别ngag,vrerspcas9 (d1135v/g1218r/r1335e/t1337r)可识别ngcg。而在sacas9中,突变体kkh(e782k/n968k/r1015h)能够将原pam序列nngrrt放宽到nnnrrt,而不增加sacas9的脱靶频率。



降低脱靶效应作为一种基因编辑工具,脱靶效应会产生大量副产物从而影响实验效率,因此如何降低脱靶效应也是值得不断探索的技术难题。有研究显示,cpf1酶的特异性比cas9高,因此使用crispr-cpf1系统进行基因编辑可以降低脱靶效应。对于spcas9及其他cas9,减少sgrna与目的dna的互补序列至20个bp以下,可以显著提高cas9的特异性。减少cas9蛋白在细胞中的存在时间也能够提高特异性,比如直接递送cas9:sgrna核苷酸蛋白复合物(rnps)相比于质粒转染,产生的脱靶效应更少。此外使用改造的cas9也能够特异性。比如使用两个单活性结构域失活的nickase cas9(cas9n),分别靶向目的基因改造区域的两侧,这种方法能在保持on-target活性的基础上降低几个数量级的脱靶效应。或者使用融合了非特异性限制内切酶foki的失活cas9(dcas9),foki需要二聚才能发挥功能,当两个dcas9分别靶向目的基因改造区域的两侧,foki才能在特定位点发生二聚从而切割dna。此外,使用内含肽失活的cas9系统(intein-inactivatedcas9)或者small-molecule-dimerizedsplit cas9系统,能够控制有活性cas9的产生,从而降低脱靶效应。最后通过cas9中几个氨基酸的突变也能够提高dna的特异性。在spcas9中,hf cas9(n497a/r661a/q695a/q926a)与ecas9(k848a/k1003a/r1060a)能够中和蛋白与dna磷酸糖骨架之间的非特异性静电作用,从而显著提高cas9对dna的特异性。



精准编辑(precise editing由于同源依赖的修复hdr效率很低(<5%),大部分由cas9/cpf1产生的dna双键断裂都由nhej修复完成,从而会引进许多随机的插入和缺失。此外,hdr的效率还与细胞的类型与状态等因素相关,因此如何提高hdr效率从而完成基因的精准编辑也是cripsr技术用于临床的巨大挑战。


其中一个做法是使用单个cas9ndonor dna底物,由于dna缺口基本不会导致nhej,因此此方法只产生很少的插入和缺失,但是其编辑效率与野生型相比显著下降,且能应用的细胞类型也十分有限。由于hdrnhej的竞争关系,使用小分子的nhej抑制剂或者hdr的增强剂也能够提高hdr的发生频率dna ligase iv的抑制剂scr7dna-pkcs抑制剂,与ku70/ku80的抑制剂或者rad51的小分子激活剂都能够提高hdr介导的基因编辑频率。此外,将细胞同步在g-phase也能够提高hdr频率。但是这些小分子抑制剂可能会影响细胞正常的功能,因此在实际使用中会有诸多限制。


同时在同源dna模板上也能做一些改进。由于切割完成后,cas9dna上的解离是不对称的。若同源模板dna能与最先被释放出的dna退火的话,hdr介导的基因编辑效率就会提高。为了避免完成编辑的dna再次被cas9识别切割,可以通过突变同源模板dna,使得hdr产物形成突变的pam


碱基编辑(base editing是一种引入点突变的新策略,它不依赖于hdr或者dna双键断裂。其主要方法是融合失活的cas9dcas9)与一个胞嘧啶脱氨酶,在dcas9sgrna和目的dna互补链形成三元复合物时,胞嘧啶脱氨酶能催化非互补链(单链)上的c(互补序列3-5个碱基位置处)转化为u,接着引发细胞错配修复从而将原先的c:g替换为t:a。这种方法的编辑效率比hdr介导的点突变更高,且插入缺失突变更少。但是仍存在一些不足:首先需要被编辑的c距离pam序列特定的位置,限制了广泛应用;其次可能无法分辨编辑窗口中的多个c,从而特异性降低。





crispracrispricripsr除了用于精准编辑某个基因,还能用于调控基因的表达。当将转录激活结构域vp64dcas9:sgrna融合,就能够激活特定基因的表达。第二代dcas9-activator融合蛋白使用了多个拷贝的vp16,三元激活因子vprvp64-p65-rta)或者串联重复的vp64表位标签肽段。此外,转录激活因子ms2-p65-hsf1等也可以通过结合sgrna上的rna发卡结构从而实现基因的转录激活。同时使用dcas9-vp64ms2-p65-hsf1,被称为协同激活调控(synergistic activation mediator(sam)),展现出了超强的转录激活能力。相反的,失活的cas9dcas9)本身或者dcas9融合转录抑制因子krab能够抑制特定基因的表达。而且,上文提到过的small-molecule-activateddcas9融合vp64krab,就能够实现特定基因时空特异地激活与抑制。


除了直接融合转录激活/抑制因子,dcas9还可以融合相关的表观遗传因子。如dcas9融合甲基转酶dnmt3a使目标dna区域100bp范围内甲基化水平升高;而dcas9融合去甲基化酶tet1能使目标dna 200bp范围内发生去甲基化。dcas9h3k27乙酰化酶p300或者组蛋白去甲基化酶lsd1的融合,能够影响目的区域近千bp的组蛋白修饰变化,从而实现基因的转录调控。


基因编辑试剂的递送(delivery由于相关的基因编辑试剂都是蛋白,核酸等大分子,不能够自发地进入细胞内。此外,在血液中裸露的核酸还会被核酸酶降解从而引发免疫反应。因此基因编辑试剂如何能克服这些障碍,从而进入细胞核发挥作用是实现体内基因编辑的一大难题。


目前用于体内基因编辑递送主要有以下方法:高压注射法(hydrodynamicinjection ,hdi),脂质-纳米颗粒递送(lipidnanoparticle deliverylnp)以及依赖病毒载体的递送(viraldelivery。在老鼠乙肝病毒模型中,hdi递送的cas9sgrna质粒能够有效的降低乙肝病毒的表达量,但是在人临床实验中,hdi的应用被其毒性和低转换效率所限制。利用lipid nanoparticle,可以将纯化好的cas9:sgrna核苷酸蛋白复合物(rnp)递送到细胞内。与递送mrna或者dna质粒相比,递送rnpscas9蛋白发挥活性的时间窗口更短,从而提高特异性,降低脱靶发生的频率。目前有多项利用lnp技术进行的基因编辑产品正在开发之中。



曾在90年代用于基因治疗的病毒载体主要存在两个问题,一是质粒被整合到了基因组中错误的位置,导致了致癌基因的激活;而是因为病毒载体存在的高免疫原性,引发了宿主强烈的免疫反应,导致多器官功能衰竭与脑死亡。经过了近20年的改进,现在的病毒载体显示出更高的转化效率与更好的安全性质。现在主要使用的病毒载体包括慢病毒(lentivirus),腺病毒(adenovirus)和腺相关病毒(adeno-associatedvirus, aav。慢病毒是逆转录病毒的一种,它能够将病毒dna整合到不分裂的细胞中。为了避免错误整合而导致的致癌基因激活,整合酶缺陷的慢病毒载体(integrase-defectivelentiviral vectors, idlvs)也被开发出来。慢病毒能够包装多达8.5 kbdna,足够满足cas9sgrna和其他调控元件的包装。


腺病毒能够感染分裂和不分裂期的细胞,而不整合进基因组。然而腺病毒有很高的免疫原性可能会引发很强的免疫反应。腺相关病毒来自细小病毒家族,是目前发现的一类结构最简单的单链dna缺陷型病毒。aav也能够感染分裂和不分裂期的细胞,而不整合进基因组;同时由于aav在人体中广泛存在,所以其免疫原性也非常低。此外,由于aav有多种血清型,它可以用于器官特异性的递送aav载体所面临的最大问题是它的包装限制为4.5kb,而最常用的spcas9的大小为4.2 kb,几乎不可能将基因编辑的所有原件组装进一个载体。改进方法之一是使用更小的cas9,如sacas9大小为3.2 kb。另一个方法是使用两个aav载体分别包装一半split-intein cas9,当两个aav载体共转时能形成完整功能的cas9从而进行基因编辑。由宾夕法尼亚大学发明的aav2.0技术授权给了regenxbio进行商业化开发,目前超过70%的临床aav项目都采用了此平台。


crispr与靶点发现

cripsr/cas9除了直接用于基因编辑,也能够用于药物靶点的大规模筛选。现有的shrna文库筛选存在两个缺点:一是rnai不能够做到完全knockdown,因此会有很多假阴性;二是rnai脱靶频率高,会导致很多的假阳性。crispr技术可以减少这些干扰,同时由于sgrna序列一般比较短,可以实现高通量的array-based寡核苷酸合成,从而构建sgrna文库。crispri lofloss-of-function)文库与crispra gofgain-of-function)文库都可以以细胞生长为指标,大规模地分析癌细胞中的遗传依赖关系。此外,在加入某药品的情况下进行筛选,可以分析该药物产生耐药性的机制。比如在黑色素瘤细胞系a375中进行braf抑制剂vemurafenib的耐药性筛选发现,肿瘤抑制因子nf2culin e3连接酶cul3以及一些组蛋白乙酰转移酶staga复合物成员的缺失,会导致vemurafenib耐药性产生。



同样的,crispr也能够用于最近异常火爆的“协同致死(synthetic lethality)”基因的筛选。最近《nature methods》上发表了trey idekerprashant mali教授的工作,他们利用crispr技术,在helaa549293t三个细胞系中,发现73个癌基因与药物靶点之间,存在着152对协同致死效应组合。其中包括28对也被证实的组合,如brca1-parp1pten-mtor。通过药物进一步确认,这个结果的准确精确性在75%以上,因此能用于大规模筛选协同致死基因。dual-grna文库是通过array-based寡核苷酸合成建立的,涵盖了10万多组基因组合。因此每个构建包含两个grna,靶向两个目的基因,根据其对细胞生长的影响从而判断两个基因之间的遗传关系。在所有的152对组合中只有16组(10.5%)是其中两个细胞系共有的,而且不存在三个细胞系共有的组合。这说明了协同致死效应存在着细胞特异性。



c2c2与与核酸检测

type vi家族的c2c22016年被报道,与cas9cpf1切割双链dna不同,c2c2是一个rna-guidedssrna切割酶。当时作者提出c2c2可以用于核酸检测,在今年4月的《science》上,张峰课题组带来了c2c2的重磅应用,用于检测核酸,其灵敏度可达到阿摩尔级(am, 10的负18次方摩尔每升),甚至有望检测出单个核酸,这对于某些诊断的应用有着重要意义。为了得到更为灵敏的信号,选择了rnase活性更强的lwc2c2。同时为了进一步提高检测灵敏度,也使用了“等温扩增”(isothermal amplification)技术。待检dna经重组聚合酶(recombinase polymeraseamplification, rpa)扩增后再经t7转录为rna,当lwc2c2识别这rna后,就可以发挥非特异的rnase活性,从而将系统里添加的rna荧光探针切开,释放出荧光。此方法的灵敏度达到了单分子级别,且能够用于癌症液体活检等。由于这套系统中的成分都可以采用冻干粉的方法保存,有利于实现这套系统的商业化。


争议!crispr的脱靶效应

虽然上文已经介绍过多种方法用于降低crispr的脱靶效应,但是今年5月《nature methods》上发表了一篇论文,文章发现在在小鼠的体内实验中,crispr技术会引入数百种意料外的基因突变。研究者们对两只接受了crispr基因编辑的小鼠和一直未接受编辑的小鼠进行了全基因组测序,结果发现两只小鼠中都出现了100多种插入/缺失突变,而对照组小鼠只有3-4种。令人诧异的是在两只小鼠中,有68%的突变是两者共有的,且这些突变的基因组序列与sgrna序列之间的同源性并不高。这篇研究迅速成为了整个生物圈关注的热点,也有科学家对此结果提出了质疑。editas medicine的首席技术官vic e. myer与著名科学家gm church联合发文,他们认为研究的数量非常有限,可能会限制观察统计的重现性和可靠性。此外作者不能排除实验动物和单个对照之间报告的基因组差异在crispr实验操作之前存在的可能性。


任何技术的发展总会遇到波折,希望这样的学术探讨能够促进对crispr技术特异性的理解,使得crispr药物早日进入市场,造福人类。



(本文转自生物医药小编)

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