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science:揭示iii型crispr-cas系统中的一种环腺苷酸信号通路时间:2017-08-22

在原核生物的iii型crispr-cas系统中,多种cas蛋白与crispr rna(crrna)组装在一起形成csm(对iii-a型crispr-cas系统而言)或者cmr(对iii-b型crispr-cas系统而言)效应复合物,csm或cmr复合物通过一种转录依赖的dna沉默来干扰入侵的核酸。在噬菌体感染细菌之后,它的dna开始转录,以便建立和维持感染周期。在细菌中,这种crrna引导的csm/cmr复合物作为一种监控复合物扫描入侵者的rna中的互补性靶序列,即前间隔序列(protospacer)。crrna引导csm/cmr结合到入侵者的rna上,从而触发csm3/cmr4亚基切割这种rna,并且同时激活cas10亚基的单链dna酶活性,从而降解转录泡(transcription bubble)中的单链dna。csm或cmr复合物通过检查crrna 5’-柄与rna靶序列的3’端侧边序列之间的互补性来避免自身免疫反应。crrna 5’-柄与噬菌体的靶rna存在碱基配对会抑制cas10的单链dna酶活性,因而保护宿主dna不被降解。crrna 5’-柄与噬菌体的靶rna不存在互补性会表明转录泡中的单链dna是非自我dna模板,从而激活cas10的单链dna酶活性,将它降解。



cas10亚基在iii-a型crispr-cas系统中也被称作csm1,在iii-b型crispr-cas系统中也被称作cmr2。它含有一个n末端hd结构域,两个小的α螺旋结构域和两个palm结构域。这两个palm结构域都具有一个铁氧化还原蛋白类似的折叠(ferredoxin-like fold),而且这个折叠区域具有核酸聚合酶和核苷酸环化酶的核心结构域。在体外,cas10的hd结构域负责降解单链dna。人们猜测在一个palm结构域中的保守性ggdd基序会产生环核苷酸(cyclic nucleotide),但是它的作用并未得到证实。来自强烈炽热球菌(pyroccocusfuriosus)的cas10(以下称pfcas10)独自时和与cmr3结合在一起时的晶体结构表明一个adp、一个3’-amp或两个atp可结合到palm结构域中的ggdd基序和p环基序的氨基酸残基上。这种腺嘌呤结合口袋的保守性提示着cas10的palm结构域可能具有酶活性,但是这种活性的性质是未知的。

为了解决这个问题,在一项新的研究中,来自立陶宛维尔纽斯大学的研究人员研究了嗜热链球菌(sterptococcus thermophilus)iii-a型crispr-cas系统中的cas10(以下称stcas10)是否具有atp依赖的催化活性。他们通过生化反应实验证实在嗜热链球菌csm(以下称stcsm)复合物中,cas10亚基的ggdd基序负责将atp转化为一种未知的反应产物x,而且这种反应依赖于mn2 , co2 或zn2 ,此外也较低程度地依赖于mg2 或fe2 。当然最为关键的是,这种反应特别依赖于靶rna识别和crrna 5’-柄与靶rna的3’端侧边序列之间的非互补性。

为了确定反应产物x的身份,这些研究人员利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、hplc和质谱技术证实反应产物x是一种环寡腺苷酸(cyclic oligoadenylate, coa)混合物,其中环三腺苷酸(ca3)是主要的产物。这就表明作为对病毒核酸入侵作出的反应,在stcsm复合物中,cas10亚基的ggdd活性位点催化coa合成。鉴于基于核苷酸的小分子化合物,如camp、cgamp、p2gpp、p3gpp和naadp,在多种有机体中作为信号分子发挥作用,他们猜测这些coa也可能是原核生物的抗病毒防御通路中的信号分子。考虑到这些基于核苷酸的信号分子通常结合到传感蛋白(sensory protein)上,他们也想要鉴定出coa的传感蛋白。

很多crispr-cas系统与似乎并不直接参与间隔序列获得、crispr转录本加工或干扰入侵性核酸的蛋白结合在一起,其中最为常见的是csm6/csx1蛋白。嗜热链球菌的iii-a型crispr-cas位点编码两个csm6同源物:stcsm6和stcsm6’,不过它们都不是这个stcsm复合物的一部分。这两个同源物具有保守的csm6结构:n末端的carf结构域,接着是α-螺旋区域和c末端的hepn结构域。分子建模揭示出stcsm6和stcsm6’的carf结构域核心区最类似于嗜热栖热菌(thermusthermophilus)csm6蛋白(ttcsm6)的相应结构域。属于hepn超家族的结构域经常表现出rna酶活性。

为了理解csm6蛋白在嗜热链球菌crispr-cas免疫系统中的作用,这些研究人员发现stcsm6和stcsm6’表现出不依赖于金属离子的单链rna(ssrna)降解活性,而且这种降解活性依赖于保守的hepn活性位点上的氨基酸残基:rxxxxh。显著的是,它们的ssrna降解活性是较弱的,仅在较高的蛋白浓度(微摩尔范围)下才是明显的。他们猜测stcsm复合物产生的coa可能作为stcsm6和/或stcsm6’的cart结构域的配体发挥作用。他们首先证实coa混合物显著地增加stcsm6和stcsm6’的单链rna酶活性,降低所需的蛋白浓度大约1000倍,而且它们不能够降解双链rna(dsrna)和单链dna(ssdna),这意味着它们是ssrna特异性的核酸酶。此外,通过开展一系列实验,他们证实stcsm6和stcsm6’的carf结构域作为stcsm复合物产生的coa配体的传感蛋白发挥作用。 

为了确定哪种coa是stcsm6和stcsm6’的激活物,这些研究人员开展核酸酶测试,结果揭示出在所有测试过的coa中,仅ca6(环六腺苷酸)激活stcsm6和stcsm6’的rna酶活性。有趣的是,是ca4(环四腺苷酸)而不是ca6激活ttcsm6的rna酶活性。在相同的反应条件下,线性的寡腺苷酸并不激活stcsm6或ttcsm6。这似乎表明coa是多种iii型crispr-cas系统中通用的信号分子。这一发现提示着csm6/csx1和与csm/cmr复合物结合的其他carf家族蛋白可能是由coa调节的。

总之,这项研究揭示出原核生物免疫防御系统中的一种基于coa的信号通路。这些研究人员证实当结合到靶rna上时stcsm6合成出的coa作为第二信使,结合到csm6的carf结构域上,激活csm6的rna酶活性,从而激活非特异性的rna降解。当csm复合物对有转录活性的dna和它的转录本的协同降解不能够抵抗病毒时,这种信号通路可能作为应急措施发挥作用。不过不能确定的是coa是否也能够作为进行细胞间通信的胞外信使发挥作用。


(本文转自生物谷)

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