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rna修饰的口述历史 i|表观遗传的黄金时代时间:2017-09-08

编者按

科研工作很多时候是从无到有的,开创新的方向新的概念一直是科研工作者的主要目标之一,表观遗传作为在近年来具有活力的领域更是如此。


近日,《自然》杂志发表了专题报道讲述表观遗传新方向——rna修饰领域的发展过程、成绩及争鸣。在此,我们邀请到了这段历史中的主要亲历者,让他们来讲述这段惊心动魄的历程,给我们读者真实展示一个正在快速发展的科研领域。


让我们用这篇精彩文章作为整个系列的开篇,揭开这个系列的序幕。


dna与rna上的分子标记是如何被重新发现?又是如何为基因表达调控的研究注入了新生?


许多出色的大想法似乎只是凭空而来,不过对于2008年的何川教授来说,他正绞尽脑汁地试图挤出一个好想法。美国国立卫生研究院(us national institutes of health,缩写为nih)刚刚推出一系列项目,打算重金支持一些高风险、高收益的研究课题。作为伊利诺伊州芝加哥大学的一名化学家,何川教授也想申请这个项目——不过他还缺少一个好想法。


在这之前,何川教授研究的是一个修复dna损伤的蛋白质家族;不过,他怀疑这些酶同样也能作用于rna。也许是幸运女神的眷顾,有天,何川教授偶然碰见了在同一栋大楼里工作的潘滔教授,潘滔教授是芝加哥大学的一位分子生物学家,专门研究rna上一种特定的化学修饰——甲基化修饰。自此之后,两人频繁会面,经过一次次激烈的讨论,一个大胆的想法逐渐成型。


当时,生物学家们正在为表观基因组(epigenome)的发现雀跃不已——无数种化学修饰的组合修饰着dna和它们缠绕的蛋白骨架。这些标记就像一个个化学注释,告诉细胞哪些基因需要表达,哪些基因应该沉默。通过这些标记,表观基因组能够帮助科学家们解释为什么尽管细胞拥有相似的dna,却能分化发育成不同的特化类型,形成结构、功能各不相同的不同组织。举个例子,就是在这些标记的帮助下,心肌细胞才能维持自己的身份,不会变成神经元细胞或是脂肪细胞。值得一提的是,癌症细胞中的表观遗传标记常常会出现紊乱。


nik spencer/nature

在两人合作的初期,大多数表观遗传学的研究工作都还集中在dna和包装它们的组蛋白(histone)上。于此形成对比的是,尽管人们已在rna上发现了近百种化学修饰,却根本没有人知道这些修饰的作用。何川教授正在研究的一类酶能够移除甲基基团,擦除甲基化修饰;于是两人不禁猜想,说不定在这些酶中,会有一两个也能在rna上发挥相同的作用。再进一步假设,如果这种化学修饰是可逆的(即能通过生物反应加上移除),那么它们就可能参与调控了一种操控基因表达的全新方式。2009年,两人获得了资金支持,正式开始寻找rna上的可逆化学标记,以及与之对应的擦除标记的蛋白质。


九年之后,这类研究获得了一个有关自己的学名:表观转录组(epitranscriptome)。何川教授和其他研究者们揭示了腺嘌呤(a,rna的四种碱基之一)上的甲基化修饰在细胞分化的过程中发挥了至关重要的作用,同时,这种修饰也很可能与癌症、肥胖以及更多其他的疾病相关1,2。2015年,何川实验室与其他两个研究组发现了在dna的腺嘌呤上也存在着同样的甲基化修饰;在这之前,甲基化修饰只在胞嘧啶(c)上被发现——这再次扩大了表观基因组的丰富程度3。大量的研究工作开始跟进,“我认为我们正逐步接近一个表观基因组和表观转录组的黄金时代。”纽约州weill cornell医学院的遗传学家christopher mason这么告诉我们,“我们已经能够渐渐确实地‘看见’这些我们早就知道会在那里的化学修饰了。”


mrna——不只是信使

分子生物学的黄金法则——中心法则——告诉我们,遗传信息从dna传到rna,再从rna流向蛋白质。由此,许多科学家都仅仅将rna看作是dna和蛋白质之间的传信员,将细胞核内编码的遗传信息送往细胞质内的蛋白质工厂,这也导致了很少会有研究者会对mrna上的化学修饰产生兴趣。


rna上的修饰甚至从来就不是一个未被发现的秘密。将何川推上表观转录组研究最前沿的化学修饰,其实早在1974年就在mrna上被人发现4。东兰辛市密歇根州立大学的有机化学家fritz rottman当时偶然在腺嘌呤上发现了一个甲基基团,于是理所当然的,他开始探究rna在基因调控表达中发挥的作用。这种带有甲基化修饰的腺嘌呤被称作n6-甲基化腺嘌呤(n6-methyladenosine),一个更加顺口的叫法是m6a。


于是,rottman和他的同事发表了相关论文,指出rna甲基化很可能是一种转录本选择性表达蛋白质的调控机制。“不过这一切都只是我们的猜想。”karen friderici的语气有些无奈,她是1974年rottman论文的作者之一,也是密歇根州立大学的一名遗传学家。在上个世纪70年代,研究小组缺乏有效的研究方法来探究这些分子标记的真实功能,“当时分子生物学才刚刚起步,许多现在唾手可得的研究技术在当时根本没有出现。”她解释道。


哪怕是在论文发表的30年之后,摆在何川和潘滔面前的依旧还是同一个科学问题——缺乏有效的实验方法。“想要确实地研究这些化学修饰其实是很难的。”潘滔教授这样告诉我们。它需要高分辨、高效率的质谱仪,以及高通量的测序技术。


世上无难事,只怕有心人。在何川实验室的两名成员:付晔和贾桂芳的努力下,研究取得了突破性的进展。付晔(现哈佛大学博士后)和贾桂芳(现北京大学研究员)当时正将注意力集中在一个名为fto的蛋白质上;fto蛋白是何川课题组研究的去甲基酶家族中的一个部分。两人认为fto蛋白很可能会移除rna上的甲基化修饰,不过要找到酶的底物并不简单。付晔和他的同事们开始合成带有不同修饰的rna片段,然后一个一个尝试,看fto是否能够擦除它们。这是一项耗时巨大的缓慢过程,在整整三年的时间里,研究小组失败了无数次。“我几乎都快觉得我永远都不可能找到fto的功能了。”付晔苦笑着回忆起那段岁月。


2010年,研究小组终于试到了他们的“真命天子”——m6a,即带有甲基化修饰的腺嘌呤。这一次,甲基化如预期般消失了。这是rna上的修饰第一次被证明是可逆的5,就像那些在dna和组蛋白上被发现的修饰一样。对何川教授来说,这个实验结果看上去足以成为证明rna系统参与基因表达调控的重要证据。


证据累积

何川课题组并不是唯一一个对m6a产生兴趣的课题组。2012年,两组独立的科研人员首次分别发表了m6a修饰的分布图6,7。研究结果揭示了来自7000多个基因上的、超过12000个的mrna的甲基化位点。“在这之前的许多年里,我们都只能在黑暗中摸索——好在马上 就能在宽广明亮的新视野里继续研究了。”这句话摘自发表在science上的一篇论文8,该文作者是dan dominissini,他也是m6a定位研究的作者之一。


根据分布图的结果显示,m6a的分布并不是随机的。根据m6a在基因组(转录组)上出现的位置,研究者们怀疑它很可能参与调控了rna可变剪切(alternative splicing)的过程。rna的可变剪切是一种重要的调控机制,这种机制使拥有相同基因组的不同细胞能够特异性地表达不同的蛋白质。


在过去的几年里,科研人员又找到了一些参与调控这些修饰标记的生化机制。每一种机制都需要三种重要的元件参与:加上修饰的修饰因子(writer),移除修饰的擦除因子(eraser),以及识别特定修饰的识别子(reader)(详见示意图)。当这一系列与m6a互作的蛋白质的性质被一一解读之后,科学家们开始逐渐意识到,m6a不仅可能影响rna的可变剪切,还会影响蛋白质翻译以及rna的稳定程度。


nik spencer/nature

举例来说,m6a的一个识别子就能将带有这种标记的mrna分子送往细胞内的降解工厂,促使这些mrna更快降解。而另一种识别子却能引导带有甲基化修饰的rna定位至核糖体,促进该蛋白质的合成。那么,我们不禁会问,到底是什么因素决定了m6a在细胞中起到的作用呢?m6a究竟是帮助蛋白质合成,还是破坏转录本呢?有两个因素决定了标记的作用:该修饰在转录本上的位置,以及与修饰结合的识别子蛋白的性质。不过要是想继续深入研究,理清这两者背后的生化机制的话,无数的工作与挑战都会随之而来。以色列特拉维夫大学(tel aviv university)遗传学家gideon rechavi客观地指出了研究的巨大难度,他也参与了绘制了m6a的分布图谱。


不过目前,科研人员至少能够确定m6a修饰在细胞分化的过程中起到了至关重要的作用。缺少该修饰的细胞将会停留在类似干细胞(stem-)或祖细胞(progenitor-)的状态。这种缺失也可能造成致死的后果:当何川及其共同工作者将小鼠中的一个m6a修饰因子失活之后,许多胚胎在还未出生前就胎死腹中。


对于m6a的作用,何川有一个自己的假设。当细胞状态发生变化的时候(比如在分化时期),细胞内的mrna当然也会发生改变。这种mrna水平上的变化(何川教授将它称作‘转录组切换’transcriptome switch)必须是精确的,且必须发生在特定的时间段。何川教授认为,甲基化修饰很可能是一种细胞内转录本的“时钟标记”,使数千条的mrna能够同步发生变化。


当然也不是所有人都信这一套。一位自称是“rna怪才”的生物学家wendy gilbert(mit麻省理工学院)就认为何川的理论有些言过其实,“这么多年以来,有一点我是很佩服他的——何川一直孜孜不倦地努力强调这些分子标记真正重要的地方。”她这么说道。但同时她也指出,很显然还有许多其他的途径也参与调控了基因的表达。一个很容易想到的例子就是microrna——一类不编码蛋白质,却参与基因沉默的小片段rna。“我不认为m6a是达成这一切的唯一途径。”她补充道。


腺嘌呤中的奥秘

科学家们很早就知道组成rna的四种碱基上都存在着许多化学修饰的类型,而与此相对的,哺乳动物的dna上似乎只有相当有限的修饰标记,而且都发生在胞嘧啶上。哺乳动物中最常见的dna修饰是5-甲基胞嘧啶,也被称为5mc,这种化学修饰极其重要,人们常把它当作是a、t、c、g之外的第五种碱基。然而即便如此,何川却依旧怀疑在基因组中还存在着其他的修饰标记。在细菌中存在着一类与m6a对等的dna修饰——n6-甲基腺嘌呤,或6ma。“细菌利用甲基化来区分内源、外源的dna。”马萨诸塞州波士顿儿童医学院的生物化学家eric greer这样告诉我们。不过研究人员一直没能在更复杂的生命系统中确认6ma的存在。


2013年,何川实验室的博士后付晔找到了一篇上世纪70年代的文献,该文献证实在海藻的dna上发现了甲基化修饰的腺嘌呤9。“没有人知道这种修饰究竟起了什么作用,也没有人继续跟进这项研究发现。”付晔说道。


付晔和当时实验室的另一名博士后骆观正决定将这项研究工作继续下去,绘制出6ma在海藻chlamydomonas dna上的分布图谱。他们在超过14,000个基因上都发现了6ma修饰的痕迹,而且6ma的分布并不是随机的,它们团聚在转录的起始位点。“我们观察到一些峰值呈现出周期性的分布,一个接着一个。”付晔这样描述。根据这些实验数据,他们推测6ma修饰或许能够促进基因的活化。


而在距离他们2000公里左右的波士顿,研究员greer和他的同事们在线虫(caenorhabditis elegans)的基因组里发现了6ma。greer当时是施扬老师实验室的一名博士后,正在利用线虫的一类突变体研究表观遗传的代际传递,这类突变体的生育能力会随着世代的传递逐渐降低。greer想知道这种不育的特性是如何实现由亲本向子代的传递。长期以来,人们一直都认为线虫缺乏甲基化修饰的分子标记,不过greer想再试一试,用结合特定甲基化修饰的抗体设计实验再次验证。他们的确没有找到任何5mc,不过他们却检测到了6ma。更加令人兴奋的是,他们发现在生育能力更差的世代当中,6ma的水平提高了,“这说明6ma很有可能就是一种传递表观遗传信息的载体。”greer说道。这个实验结果出乎了所有人的意料,在这之前,人们并不是没有在多细胞生物中寻找过6ma,不过由于6ma的表达水平实在太低了,没有人能够真正检测到它的存在。


联系greer的发现,施扬老师想起了何川实验室在海藻中发现了6ma,他觉得这是一个合作的好机会。当何川教授听说了施扬老师的发现后,他也十分激动,当即就决定合作。几个月之后,何川教授又遇到了另一名同行,他在果蝇里也发现了6ma修饰的存在。“我当时激动得都快晕倒了。”何川告诉我们。2015年4月,这三篇论文同时发表在cell上10-12


并不是只有何川等人才对6ma 感兴趣。当时正在耶鲁大学研究表观遗传学的andrew xiao在论文发表后看到了这三篇研究,xiao和他的同事们已在哺乳动物细胞里发现了6ma的存在,不过他们还没有发表这项研究结果,“我们本来放心地以为没人会对这个领域产生兴趣的。”xiao也很无奈,cell上发表的论文告诉了他这个残酷的现实,“我们意识到我们得抓紧时间了。”


一年之后,xiao和他的同事们证实了6ma以极低的浓度出现在了小鼠的胚胎干细胞之中。当研究者们细究6ma的分布时,他们发现6ma的最高峰值都集中在x染色体上——这似乎暗示了6ma参与介导了基因沉默。同时,研究者们也发现了一种疑似6ma擦除因子的蛋白质。


直到现在,xiao还不能阐明6ma的作用。不过他还是告诉我们,6ma应该类似于一个分子开关,在发育过程中起到了至关重要的作用。它仅仅在很短的时间内存在着——然后就像有一阵大浪袭来,所有的标记都会像沙滩留痕一般消逝无踪。


“xiao的论文对我们而言简直是一枚重磅炸弹。”威尔康奈尔医学院的研究者samie jaffrey这么评论,“它明确指出了6ma是一个功能性的元件。”施扬老师和何川老师都表示他们也在哺乳动物细胞中发现了6ma的存在,不过具体的实验结果还未发表。


不过研究者们也不能过分乐观,施扬老师告诉我们,对6ma生物学意义的研究还有很长的路要走。即使是运用现有的最先进的技术,也只能堪堪检测到6ma修饰,并不能实现该修饰的精确定位;而且不同组织中6ma的修饰模式也可能存在很大的差异。


同时,还有一些关键的问题也尚待解决。纽约大学药学院遗传学家mamta tahiliani就认为虽然有关6ma的研究工作相当振奋人心,但不可否认的是,还没有一项研究工作能够令人信服地证明该标记能够遗传给后代——而可遗传正是表观遗传中不可或缺的特性之一。


寻找新标记——工作进行中

正当不少研究者潜心于m6a和6ma的功能研究时,另一些科研工作者却已经开始寻找起新的化学修饰了。去年,何川、rechavi等人报道了另一类发生在rna腺嘌呤上的化学修饰——n1-甲基腺嘌呤(m1a)。尽管与6ma的原理不同,该标记似乎同样能够促进蛋白质的翻译。何川认为m1a还可能在“转录组切换”的过程中发挥作用,帮助转录本同时产生变化。


紧接着,在今年1月,jaffrey等人又报道了另一类发生在mrna帽端附近的化学修饰。研究人员发现,拥有这类修饰(被称作m6am)的mrna具有更加稳定的生化性质,产生这种变化的原因是因为这类mrna的帽结构更难被移除15。“能够调控基因表达的mrna修饰的数量及其复杂程度远比我们想象的要多,这对研究人员来说是个激动人心的好消息。”gilbert说道。


而这些新发现也不可避免地伴随着“科学式的”争吵。jaffrey的研究15表明何川实验室找到的fto蛋白(m6a擦除因子)实际上是m6am的去甲基化酶。而在去年10月,何川实验室又发现16xiao找到的dna修饰6ma的擦除因子能够更好地擦除某一特定rna上的m1a。不过对于一个正在经历蓬勃发展的新兴学科来说,这类分歧实在是再正常不过了。


“我们现在仅仅只是处在故事的开端。”rechavi客观地评论道。随着科技的进步,科学家们最终一定能够更加清晰地理解这些分子标记。这类研究工作中蕴含的无限可能性让mason每天都觉得自己非常幸福,“能够在这个领域工作真是太好了。”


(本文转自23plus

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