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「免疫应答」在aav基因治疗中的挑战与解决策略时间:2018-09-13

2012年,荷兰uniqure公司首个基因治疗药物glybera获欧盟批准,该药物基于腺相关病毒(aav)载体用于家族性脂蛋白脂酶缺乏(lpld)成人患者的治疗。

 

去年,fda批准的第一个体内基因疗法是spark therapeutics公司研发的luxturna,同样使用aav作为递送载体,它被施用于眼睛以治疗罕见的遗传性失明。

 

aav是一种约22nm大小的无包膜病毒,其衣壳具有二十面体构型,属于细小病毒科依赖病毒属,它的生产需要与辅助病毒(腺病毒或疱疹病毒)进行共感染以便复制。与其他病毒载体如腺病毒相比,aav由于其非致病性低免疫原性并且血清型众多,成为临床使用的有吸引力的载体。

  

(图片来源:pharmaceutical technology)

 

目前,aav在体内基因疗法中占据着举足轻重的地位,根据gene therapy clinical trials worldwide的数据,截至2017年11月,全球已有204项临床试验使用了aav载体。

 

aav基因治疗的一大挑战:免疫应答


基于aav载体的基因疗法在针对免疫特权部位时表现出显著的成功,例如lebers先天性黑朦等视网膜疾病,但对于全身性疾病,基因疗法可能导致的免疫反应仍然是一个不能逃避的重大挑战

 

人体免疫系统非常善于抵抗细菌和病毒,这是我们抵御疾病的基础,但对基因疗法而言,这有可能是致命的挑战。基因传递载体正是这些细菌和病毒,科学家必须对载体进行修饰以避免机体的自然监视系统,并且大剂量载体的施用可能触发突然的免疫反应,致使不可挽回的严重疾病甚至死亡。

  

(图片来源:gene therapy)

 

1999年,宾夕法尼亚大学的一项临床试验使基因治疗领域停滞不前。试验中,患有鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏症的杰西基辛格注射了携带校正基因的腺病毒(ad),5天后他由于强烈的免疫反应导致多器官衰竭和大脑死亡。此后,美国基因治疗临床试验的数量在1999年达到顶峰之后,降至2001年的34个。

 

这是基因治疗引发免疫应答的一个惨痛例子,这也迫使人们吸取教训。到如今,基因治疗研究出现了令人惊讶的复兴,其中很大一部分基于当时领导临床试验的威尔逊在后来研发的aav载体。aav已显示出转导多种组织的能力,提供稳定的转基因表达并表现出相对低的免疫原性。

 

然而,与其他病毒载体不同,aav在小鼠模型中不具有免疫原性,其免疫原性仅在大型动物模型和人类受试者中变得明显。此外,人类是aav的天然宿主,并且对aav抗体表现出高血清阳性率。这限制了aav载体在具有预先存在的中和抗体或记忆t细胞的患者中的广泛应用。

 

正在进行的临床试验也考虑到了这一点,研究人员排除了可能对治疗不起作用的患者。例如,如果患者预先存在的aav9抗体滴度水平高于某一阈值,avexis公司则将患者从i期脊髓性肌萎缩临床试验中排除。类似地,biomarin公司针对a型血友病的i/ii期临床试验,已经将预先存在针对aav衣壳的抗体的患者排除。

 

针对aav的免疫应答

先天性免疫



具体机制:

(1)aav载体通过受体介导的内吞作用进入细胞,在其内体逃逸后进入细胞核,发生病毒衣壳的脱壳,然后释放aav基因组并诱导基因表达;

(2)aav的内化可能触发各种先天免疫信号通路的激活,如tlr、nf-κb和upr,这导致促炎细胞因子和趋化因子的分泌;

(3)这些分子进一步激活并引起先天免疫细胞如嗜中性粒细胞、树突状细胞(dc)和巨噬细胞向转导细胞的浸润,从而将其清除;

(4)aav也可以通过与补体蛋白的结合来触发调理作用,例如:补体c3可引起巨噬细胞的和树突状细胞的活化。


适应性免疫


首先,人体中预先存在的免疫力,即针对各种aav血清型的中和抗体能引起适应性免疫。据估计,健康人中aav中和抗体的血清阳性率普及范围为:aav1约67%、aav2约72%、aav5约40%、aav6约46%、aav8约30%、aav9约47%。基于aav衣壳的结构同源性,针对一种血清型的抗体可能与其他血清型产生交叉反应。aav7和aav8最初是从恒河猴中分离出来的,在血清学上也是独特的,与其他血清型的交叉反应最小。

 

另外,aav的病毒衣壳或转基因编码的蛋白可以诱导机体的细胞和体液免疫。重组aav衣壳降解后,抗原肽交叉呈递给mhc i分子以激活细胞毒性t细胞(ctl),ctl主要负责对aav的适应性免疫应答。

 


具体机制:

(1)重组aav转导靶细胞后,可以通过细胞蛋白酶体将载体降解为抗原肽,然后加载到mhc i(主要组织相容性复合体1)上,并在细胞表面呈递给cd8 t细胞。这些活化的cd8 t细胞破坏了转导的宿主细胞。同时,活化的cd8 t细胞也释放炎性细胞因子,如ifn γ、tnf-α和il-2,间接激活cd4 t细胞;

(2)另外,如果aav被抗原呈递细胞(apc)捕获,将通过mhc ii复合物呈递给cd4 t细胞的t细胞受体(tcr),使cd4 t细胞活化;但与ad相比,aav载体的适应性细胞介导的反应要弱得多。一个主要原因可能是aav无法有效感染apc,如树突状细胞和巨噬细胞;

(3)这些活化的cd4 t细胞分泌炎性细胞因子,如il-2、il-4和il-5,以进一步激活b细胞,在适当的共刺激信号(如cd40l)的存在下也可以募集其他免疫细胞;

(4)活化的b细胞分化为浆细胞,分泌特异性中和抗体);

(5)活化的浸润性免疫细胞如嗜中性粒细胞、dc和巨噬细胞清除了抗体结合的载体颗粒或载体转导的靶细胞;它们还可以通过内吞aav和放大整体反应作为apc。

 


解决策略


为了避免免疫应答可能导致的问题,研究人员正在测试各种策略,以最小化基因治疗带来的免疫应答。例如,针对免疫特权部位(如眼睛和大脑)的疾病开发基因疗法,一来规避免疫应答带来的风险,二来只需少量施用载体,也避免了临床应用的制造问题。

 

目前,在遗传性视网膜疾病中枢神经系统疾病的临床试验中,aav已经实现了相对的安全性和耐受性。另外,还有证据表明转基因靶向肝脏能诱导免疫耐受。

  

aav介导的基因转移后促成肝脏免疫耐受(图片来源:annualreviews)

 

但是,对于大多数疾病,研究人员还是必须得正视问题,迎难而上。例如,针对血友病基因治疗临床试验中患者出现的肝酶升高,许多公司都不约而同地选择使用免疫抑制剂类固醇来稳定肝酶水平。

  


类固醇在血友病基因治疗临床试验中使用广泛(图片来源:annualreviews)

 

除了免疫抑制药物的使用以外,还有一些临床开发的策略:


 

尽管仍存在很大挑战,但基于成功的先例以及逐日繁荣的基因治疗领域,我们没有理由不持乐观态度。近年来,基因治疗的安全性得到更多的重视,人们也更加了解可能出现的临床试验中可能出现问题,以及拥有相应的措施。一般的基因治疗,尤其是基于aav载体的基因治疗,已经十分成熟,大型制药公司都正在涌向这个领域,这不是没有原因的。

 

参考出处:

https://www.genengnews.com/gen-exclusives/gene-therapy-may-not-be-a-viable-option-for-many-patients/77901045

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28961410

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24023004


(本文转自医麦客)

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