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science亮点 | 活细胞中实时观察基因编辑时间:2019-09-12

基因编辑是指在活体基因组中进行dna插入,删除或者突变的一项技术,它还有可能导致染色体重排,易位或者替换【1,2】。测序技术可以识别和检测这些变化,但是,却做不到实时动态监控。传统的荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization,简称fish)需要样本dna发生变性,而荧光标记的cas9技术的样本则需要固定【3,4】。随着基因组研究的逐渐深入,学界亟需一种可以在活细胞中实时动态观测基因变化的技术。


2019年9月6日,来自斯坦福大学的lei s. qi团队在science杂志上发表了题为 crispr-mediated live imaging of genome editing and transcription 的文章,报道了一种命名为“crispr活细胞荧光原位杂交技术(crispr livefish)”的活细胞成像新技术。这种技术实现了在活细胞中实时观测单个细胞的基因组dna和rna片段,进而实时追踪基因组编辑、转录、重排和功能变化。



如下图所示,作者首先将等量的dcas9-egfp融合蛋白和荧光标签cy3标记的先导rna(grna)合称为荧光-核酸-蛋白复合物(fluorescent-ribonucleoproteins,简称frnp),这个复合物特异针对3号染色体上一段重复序列。接着,作者将其转入人类骨髓瘤细胞系u2os。流式细胞术检测发现,转入4小时后,95%的grna荧光信号发生淬灭,但是,在3号染色体上,却发现了稳定且高强度的荧光信号,这表明,染色体上已经形成了稳定的dcas9-grna复合体。基于上述实验,作者构建了crispr livefish技术。并将这一技术加以推广应用。

 

 

首先,应用crispr livefish技术,可以在活细胞水平识别和定义染色体疾病。小儿帕套综合征(patau syndrome),又称为13-三体综合征,患者具有3个13号染色体,从而导致严重的器官病变,体力智力低下,最终致命。作者设计frnp特异针对13号染色体的重复序列,从而在患者单个活细胞中观察到3个重复的荧光信号,也就是3个13号染色体。


其次,应用crispr livefish技术,可以实时观测dna双链断裂(double-strand breaks,dsbs)。作者在u2os细胞系中稳定表达带有dna双链断裂感应子apple的53bp1融合蛋白(即构建u2os-53bp1-apple 细胞系),然后共转入导致3号染色体ppp1r2位点双链断裂的基因编辑rnp(cas9/gppp1r2)和标记荧光信号的frnps。作者发现,基因组双链断裂处招募了大量53bp1蛋白,并且,这一高速且动态的过程持续了数小时之久。与此同时,作者还观察到诸多基因编辑细节。比如,53bp1蛋白的招募以及随后解离,表示此处双链断裂已然修复完毕。再比如同一位点53bp1反复招募解离,表示此处进行着活跃且反复的基因修复。还比如不同位点处于同一53bp1募集区(foci),则标志着发生同源重组。


再次,应用crispr livefish技术,可以实时观测染色体易位。作者在上述细胞体系中同时转入两组基因编辑rnp,分别针对3号染色体的gppp1r2位点和13号染色体的spaca7位点。作者发现,这两个位点的基因活动极为相似,并且,这两组染色体从最初的保持一定距离,到缓慢的靠近,最终长时间相连,很可能是发生了染色体易位。随后,作者通过分子克隆技术,证实了此处的确发生了染色体易位。


最后,应用crispr livefish技术,可以同时实时观测rna和dna。作者采用u2os 2-6-3细胞系,此细胞系中含有一段laco重复序列,并且,其下游连有多西环素(doxycycline,简称dox)诱导的ms2序列读码框架。作者同时转入针对laco dna的cas9 grna和针对ms2 rna的cas13 grna【5,6】,发现,在dox诱导下,dna和rna都被成功标记,并且,ms2逐渐聚集在laco区域。


这篇文章是方法学研究的精品。作者综合了活细胞显微术,荧光原位杂交术和crispr基因编辑技术,创建了crispr活细胞荧光原位杂交技术(crispr livefish)。这一技术可以实时检测单细胞中的dna双链断裂,染色体易位,dna-rna相互作用等活细胞基因变化,并且,可以识别和定义染色体疾病。这一技术的亮点有两处,一是可以直接应用于活细胞,从而发现基因组活动的动态细节。二是通过与其它分子生物学手段的联合应用,相辅相成,可以更加高效深入的研究基因组的活动变化。


原文链接:

  

(本文转自自bioart)

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