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超越crispr,实现碱基任意转换与增删,可修正89%的人类遗传病时间:2019-10-23

2019年10月21日,单碱基编辑技术开创者,broad研究所刘如谦(david r. liu)教授在nature杂志发表一篇研究论文。论文名称为《search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor dna 》


该研究开发了一种全新的精准基因编辑工具——先导编辑(prime editor),无需依赖dna模板便可有效实现所有12种单碱基的自由转换,而且还能有效实现多碱基的精准插入与删除最多插入44个碱基,或删除80个碱基
nature 杂志评论这一技术是“超精确的新型基因编辑工具”, science 杂志评论它是“超越crispr”的重大突破,哈佛大学教授,crispr先驱乔治·丘奇(george church)盛赞这一成果:“朝着正确方向迈出的一大步”。

 

先导编辑(prime editor),将cas9酶蓝色)和逆转录酶红色)结合成复合物,在grna(绿色)的引导下,将该复合物带到dna双螺旋(黄色和紫色)的特定位置,并保留在该位置插入新dna序列。

 

 

crispr基因编辑技术是一种在2012年被发明的极其强大的基因组编辑工具,2013年2月,张锋等人首次将crispr技术用于人类细胞的基因编辑,很快取得了一系列辉煌的成果,目前crispr基因编辑技术已经开始用于人类遗传病治疗的临床试验。但是,目前crispr基因编辑技术仍然显得有些笨拙。

 

crispr基因编辑有时会存在脱靶效应,此外,crispr基因编辑依赖于dna双链断裂,从而可能导致基因编辑后的细胞出现不可预期的混乱,这些缺陷的存在限制了其在基础研究和农业中的使用,并在医学上构成安全隐患。

 

2016年4月20日,刘如谦等人在 nature 发表论文,首次可以通过可靠、可预测的方法,实现对改变活细胞基因组中的单个碱基进行修改。

 

2017年10月25日,刘如谦等人进一步升级,开发出了单碱基编辑器(base editor),将cas9和apobec(胞嘧啶脱氨酶)整合,能够在不造成dna双链断裂的情况下,将a-t碱基对转换为g-c碱基对,实现对基因组点突变的定点矫正修复。

 

 

许多遗传性疾病是由单个碱基突变导致的,因此,单碱基编辑器的出现,为治疗许多单碱基遗传病提供了强大的方法,刘如谦也因此被 nature 评为“2017年影响世界十大科学人物”。

 

但是,单碱基编辑器有局限性,并不能任意编辑所有碱基,而且,2019年3月1日,中国科学家杨辉高彩霞各自在 science 发表研究论文,证实单碱基编辑器存在严重的意料之外的脱靶效应,这也为原本前景乐观的单碱基编辑技术蒙上了一层阴影。

 

不能任意编辑所有碱基存在脱靶效应,这是单碱基编辑技术面临的两大问题,为了解决这两个问题,许多卓越的科学家在不懈努力,以期开发出效果更好、脱靶性更低的单碱基编辑系统。

 

为了解决这两个问题,刘如谦团队在cas9酶grna两方面进行了重大改造:
一是改造grna,在其3’末端增加了一段rna序列,形成所谓的pegrna
二是改造cas9酶,将cas9酶的变体(h840a突变型,只切断含pam的靶点dna链)逆转录酶融合,形成融合蛋白复合体
pegrna的3’端序列有双重角色,一段序列作为引物结合位点(pbs),与断裂的靶dna链3’末端互补以起始逆转录过程,另一端序列则是逆转录的模板(rt模板),其上携带有目标点突变或插入缺失突变以实现精准的基因编辑。

 

 

 

刘如谦团队对 prime editor 在人类和小鼠细胞中进行了175种以上的基因编辑实验,成功修复了导致镰状细胞性贫血症和tay-sachs病的基因突变。

 

镰状细胞性贫血症,是一种常染色体显性遗传病,因编码血红蛋白的基因中发生了a到t的单碱基突变,导致血红蛋白β-肽链第6位氨基酸谷氨酸变成缬氨酸,构成镰状血红蛋白,取代了正常血红蛋白。该疾病的纯合子很难存活到成年。

 

tay-sachs病,是一种常染色体隐性遗传病,因hexa基因发生突变,多出4个碱基,导致hexa基因编码的脂质分解酶失活,从而导致神经节苷脂在大脑中聚集至中毒水平,通常患者只能存活至两三岁,该疾病在犹太人中发病率相对较高。

 

这两种遗传病,使用传统的基因组编辑系统要么无法修复,要么效率低下。
而刘如谦团队使用新技术成功修复了这两种基因突变,不仅效率大大提高,而且脱靶效应更低,刘如谦团队在论文中表示,该技术“原则上可以修复75000种已知致病性人类遗传变异的89%"。
为了促进先导编辑(prime editor)发展,进一步检验和改进这种新型基因编辑方式,刘如谦团队已向学术界和非盈利组织免费公开这一系统。

 

本文转载自微信公众号bioworld

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