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《科学》:crispr终于法力无边了!麻省科学家创造出几乎无限制的crispr/cas系统,基因编辑想改哪里改哪里!时间:2020-03-30

我们知道,crispr/cas技术虽然已在短短几年内成为目前最好用的基因编辑工具之一,但是实际上它的应用还要受到特定基因序列的限制,这就意味着它并不能够随我们所欲地编辑所有的基因片段


而一项最新的研究则完全放开了crispr/cas的束缚,现在“基因魔剪”可以说是真的“想剪哪里剪哪里啦”!


这项新研究提出了两种人工改造的cas酶,spg和spry,其中spry几乎可以不受限制地对全部序列具有编辑活性。这意味着我们能够对以前根本无法涉及的致病突变进行修改,基因编辑能为人类做的贡献大大增加了[1]!这项研究发表在《科学》杂志上,通讯作者是来自麻省总医院的benjamin p. kleinstiver。

图源 | pixabay

我们都知道,crispr/cas系统原本是原核生物的一种自我保卫机制,crispr/cas的存在能够让原核生物避免外源遗传物质的入侵。除了作为识别重点的crispr序列,其实还有另外一个重要的序列,原间隔序列临近基序(pam)。简单来说,没有对应的pam,就启动不了crispr/cas系统。


pam根据cas酶的种类不同而有所不同,目前使用最广泛的、来自化脓链球菌的spcas9,主要识别的是ngg序列


很显然,仅能识别ngg是不足以满足对所有序列编辑的需求的。


对蛋白来说,结构决定功能。spcas9识别ngg,主要是通过r1333和r1335两个位置氨基酸侧链和鸟嘌呤的结合[2],那么我们是不是可以通过替换氨基酸来让spcas9识别其他的pam序列呢?


关键在r1333和r1335

其实已经有很多科学家尝试过利用分子进化的方法,改变pam作用域中的氨基酸来改变cas酶的pam偏好。比如我们之前也介绍过的。


顺便一提,xcas9的战绩是适用性扩大了4倍


而今天介绍的研究,则是采用了另一种思路,结构导向工程(structure-guided engineering),精确地对个别氨基酸序列进行替换,以获得想要的蛋白性状。


为了一步步扩大spcas9的pam适用范围,研究者们决定先搞出一个能够识别ngn的1.0版本来。


科研经验告诉学者们,识别pam的关键就在于某个或某几个氨基酸残基[3]。通过比对spcas9-vqr、spcas9-vrqr等前人开发的变体和它们识别的pam序列,研究者们很快提出了几个可能的氨基酸取代方案。为了测试这些变体的活性,研究者们还开发了一种高通量测试pam活性的方法(ht-pamda)来分析变体对pam的偏好。


最终,在各种氨基酸取代组合方案里,研究者们获得了一种能够基本等效识别nga、ngc、 ngg、ngt的变体,它具有五个氨基酸取代(d1135l/s1136w/g1218k/e1219q/r1335q/t1337r),被命名为spg


通过在人类细胞中进行的编辑测试,我们可以看到,spg对ngn可实现基本等效识别,且效率要比spcas9以及其他的变体更高。进一步实验显示,spg对ngg的编辑活性达到51.2%,其他三类则达到了53.7%


此外,spg也适用于单碱基编辑器(be)。


spg可识别ngn,且活性更高

好,接下来继续扩大pam范围。搞定了ngn,现在把nan也加上,试试nrn(r即a g)。


这一次,研究者们瞄准的是r1333位可能与腺嘌呤产生的化学反应。ht-pamda测试出来的结果显示,把r1333位置替换成丙氨酸、半胱氨酸或脯氨酸就可以有效识别nrn了。


经过一系列细化和筛选,最终研究者们得到的是在spg(l1111r/a1322r)基础上,增加r1333p、a61r、n1317r的2.0版,spry


为什么叫spry呢?


虽然在ngn上,spry活性不如spg,不过spry同样能够有效识别nan,nrn成立。比较惊喜的是,spry同样能够识别nyn(y即c t)。在实验中,全部31个nyn位点,spry编辑效率高于20%的有13个(42%),当然,普通的spcas9是一个也做不到的


鉴于对nrn的识别活性比nyn更高,大约是一倍,spry就叫做spry了。


与spg同样,spry也适用于单碱基编辑。


spry可识别几乎全部pam

不言而喻,spg和spry大大扩大了crispr/cas系统的极限,几乎整个基因组都“触手可及”了!


另外,根据实验数据,spg和spry的脱靶效应与spcas9水平接近,新增的脱靶问题主要来源于扩展大的pam范围,而另外一种hf1变体则能够消除这类脱靶并提升编辑效率


说不定我们还可以期待一下3


本文转载自微信公众号“奇点网”

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